用锁相放大器优化激光扫描显微镜的信噪比SNR

May 25, 2021 by Claudius Riek

提高信噪比（SNR）对于每种激光扫描显微镜应用都是理想的。它可以观察样本中较小的变化或更快的过程。这篇博客文章解释了与仅使用数字转换器相比，使用锁相放大器或Boxcar平均器如何提高SNR。此外，我详细阐述了现代锁相放大器如何通过在多个频率上解调一个信号，例如，并行捕获来自两个拉曼模式的信号，同时恢复各种独立的信号。

安装程序

激光扫描显微镜方案包括许多利用线性相互作用的不同技术，如吸收显微镜到非线性相互作用，如多光子显微镜或拉曼技术，如受激拉曼散射（SRS）或相干反斯托克斯拉曼（CARS）显微镜。虽然物理交互的类型不同，但设置非常相似。图1描述了两个最典型的方案。在图a）中，显示了标准激光扫描显微镜：左侧是作为光源的激光。光束进入显微镜，扫描仪以系统的方式推进样品上的照明点。典型的技术是带载物台的样品扫描仪、逐行扫描样品的检流计镜或旋转圆盘扫描仪，从而实现更复杂的测量模式。激光束与样品相互作用后，出射光照射到光电二极管上。检测电子设备，例如数字转换器、锁定放大器或Boxcar平均器，分析产生的光电子。电子设备捕获信号并使用来自扫描仪数据的空间坐标描绘图像。当使用锁定放大器或盒式平均器时，需要调制机制，例如斩波轮、声光调制器（AOM）或电光调制器（EOM）。图b）显示了例如用于SRS和CARS显微镜的具有泵浦探针照明的显微镜设置。激光器有两个输出分支，探测分支（红色）和泵浦光束（绿色）。在样品中的相互作用过程中，只有泵分支被调制并将该调制压印到探针分支上。显微镜后，用光电二极管（PD）检测探测光束，并用锁定放大器记录。当然，有许多方法可以提高这种系统的SNR。这里我们只关注电子产品。在下一节中，我将讨论锁相测量相对于数字转换器的优势，并解释该技术在实现高SNR方面的优势。

图1：典型的激光扫描显微镜设置。a） 设置多光子显微镜，通过扫描仪（例如样品扫描仪、检流计扫描仪）将样品激光照射到显微镜中。采样后，光子通量与PD一起传输，并送入锁定放大器。b） 泵探头技术的典型设置，如SRS或CARS成像。激光系统提供探测分支（橙色线）和泵浦分支（绿色线）。后者被调制，然后在显微镜中与探针束共同聚焦到样品中。在相互作用之后，它由光电二极管（PD）检测并用锁相放大器分析。

数字化仪与锁定放大器

大多数情况下，数字化仪用于在激光扫描显微镜中获取数据。它们非常容易同时使用和记录多个信号，例如光学信号和来自扫描系统的相关坐标。典型的结果图像如图2a所示。成像的珠子可以被识别，但是SNR很差，因为整个图像都被噪声淹没。然而，锁定放大器可以以更好的SNR恢复图像，如图2b所示，从相同的信号开始，在相同的测量时间窗口内。现在可以清楚地识别珠子，并且有最小的可见噪声。总之，数字转换器捕获的噪声比锁定放大器多得多。

对于这篇博文中的所有数据，信号来自具有典型信号功率的SRS测量，但为了演示目的，使用AWG进行了回放。与数字转换器相比，锁定放大器的优点与该信号过程无关，而是许多信号所固有的。通过观察不同技术的基本噪声结构和测量滤波器功能，这一点变得很清楚。

图2：用a）数字转换器和b）锁定放大器在相同测量时间内拍摄的图像的比较。在图b）中，四个珠子缺失，因为它们由具有另一拉曼响应的不同材料组成。

激光扫描显微镜测量中的典型噪声结构如图3b所示。与大多数信号一样，它由低频1/f噪声的典型组合组成，如灰色区域所示，白噪声基底与频率无关，以浅蓝色显示。此外，多个噪声峰值通常来自拾波器，例如电源线或无线电信号。为了最大限度地减少影响测量的噪声，滤波器的使用是公认的。频域中的滤波器功能必须覆盖扫描速度给定的整个信号带宽。对于128x128像素、帧速率为10 Hz的图像，其频率约为164 kHz。该带宽中的信号和噪声分量都有助于记录的信号。在频域中，这对应于滤波器函数的横截面（见蓝色虚线）和噪声基底。

数字化仪以有限带宽以0 Hz为中心进行测量。这包含大量的噪声，这在图3a中的时域测量结果中也很明显。相反，锁定放大器的测量原理允许将测量转换到噪声本底低得多的频率。（有关详细讨论，请参阅我们的锁定检测白皮书、本博客文章和其他博客文章。）因此，在不同中心频率下，同一滤波器函数中包含的噪声的特征是噪声小得多（见橙色区域）。转换到白噪声基底占主导地位的更高频率时，它只受到光子通量的散粒噪声的限制，因此，量子受到限制。

图3a中的时域显示了同一测量时间窗口内不同结果的SNR比较。数字转换器测量结果以蓝色显示，而调制频率增加但测量带宽相同的锁定放大器测量结果以黄色、绿色和红色显示。锁定测量的优势显而易见。当然，重要的是要记住，比较将始终取决于激光系统和设置的噪声以及使用中的检测器。

现代锁相放大器的作用不仅仅是降低噪声。它们可以同时在多个频率解调一个信号，从而在单个测量中恢复更多信息。我将在下一节中讨论此功能。

图3：不同调制频率的SNR比较。a） 随时间变化的信号幅度。b） 功率谱密度被描述为频率的函数。典型的噪声具有1/f分量（灰色区域），该分量过渡到白噪声基底（浅蓝色区域）。在三个调制频率DC、f_1和f_2处描绘了相同的滤波器。彩色过滤器区域显示累积的噪声量。用数字转换器捕获的信号（蓝线/区域）比用锁定放大器测量的其他信号表现出明显更多的噪声。

并行捕获多个图像

让我们想象一下以下实验：在两种不同的拉曼模式下分析样品，以表征或区分不同的材料。例如，这是包含PMMA和PS珠的珠的集合的情况。为了同时记录两者，我们可以设想一种基于图1b中泵探针显微镜设置的扩展测量方案。这里，第二泵浦光束被添加有与第一泵浦光束之一不同的调制频率。现在，两个抽运光束在时空上与探测光束组合，并聚焦到样品上。

图4：泵浦-探针显微镜设置示意图，其中两个泵分支（绿色和蓝色线）以不同频率调制，一个探针分支来自一个激光系统。所有三个都在时间上重叠并共同聚焦到样本上。显微镜之后，只有探针被检测到，并用检测电子设备（如锁定放大器）进行分析。

在显微镜之后，探测光束被检测并作为两个调制频率和扫描器的坐标输入锁定放大器。对于测量，第一泵浦光束的波长差被调谐为与PMMA的拉曼模式共振，而第二泵浦光束被设置为与PS的拉曼模式谐振。探测光束在调制频率f1处携带PMMA量的信息，在调制频率f2处携带PS量的信息。在两个频率下并行解调光电二极管的信号，可以在两个不同的拉曼模式下完美地并行记录样本图像，如图5所示。

图5：通过逐行图像采集，实时同步记录PMMA和PS混合珠的图像。在左侧，只有PMMA珠可见。在中间，只有PS珠子可见。在右边，蓝色和橙色线条处的两幅图像的切割显示了这两种物种之间的距离。

图5（右侧）中的图显示了图像中沿蓝色和橙色线的切割。两个数据集的完美对齐是显而易见的。同时获取两个互补数据集是有利的，因为它可以防止两个测量之间的参数发生任何变化。这对于调查仅在几秒钟内发生的过程更为重要。

总之，锁相放大器可以提高激光扫描显微镜系统的信噪比。此外，现代相定放大器可以帮助结合创新的测量方案，例如双泵探针拉曼显微镜。为了帮助您进一步优化测量，您还可以考虑直接边带调制（在本视频中讨论）或使用boxcar平均器（如图所示）以及锁相放大器滤波器的正确设置（本视频中解释）。